Гост отбор проб кормов на гмо

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ГОСТР

СТАНДАРТ ___ __

российской 56058—

ФЕДЕРАЦИИ 2014

КОРМА И КОРМОВЫЕ ДОБАВКИ

Методы идентификации и количественного определения ГМО растительного происхождения

Издание официальное

Предисловие

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 454 «Охрана жизни и здоровья животных и ветеринарно-санитарная безопасность продуктов животного происхождения и кормов»

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 июля 2014 г. No 705-ст

4 8ВЕДЕН 8ПЕРВЫЕ

Правила применения настоящего стандарта установлены в ГОСТ Р 1.0—2012 (раздел 8). Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется е ежегодном (по состоянию на 1 янеаря текущего года) информационном указателе «Национальные стандарты», а официальный текст изменений и поправок – в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске информационного указателя «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также е информационной системе общего пользования – на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (gosl.ru)

© Стандартинформ. 2015

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КОРМА И КОРМОВЫЕ ДОБАВКИ

Методы идентификации и количественного определения ГМО растительного происхождения

Feed and feed additives.

Methods of identification and determination GMO of plant origin

Дата введения — 2015—07—01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на корма, кормовые добавки и сырье для их производства и устанавливает метод идентификации и количественного определения содержания генетиче-схи-модифицированной сои (далее – ГМ сои) и генетически-модифицированной кукурузы (далее – ГМ кукурузы) методом полимеразной цепной реакции (далее – ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR).

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 31719—2012 Продукты пищевые и корма. Экспресс-метод определения сырьевого состава (молекулярный)

ГОСТ Р ИСО 6497-2011 Корма для животных. Отбор проб

ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ Р 51848-2001 Продукция комбикормовая. Термины и определения

ГОСТ Р 52178-2003 Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетичесхи-модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения

ГОСТ Р 53244-2008 (ИСО 21570:2005) Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически-модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот

ГОСТ Р 55576-2013 Корма и кормовые добавки. Метод качественного определения регуляторных последовательностей в геноме сои и кукурузы

Примечание – При пользовали настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная осыпка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная осыпка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, га положение, в котором дана осыпка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины, определения и сокращения по ГОСТ Р ИСО 6497, ГОСТ Р 51848, ГОСТ Р 55576 и ГОСТ 31719.

4 Условия выполнения испытаний и требования безопасности

Условия выполнения испытаний и требования безопасности – по ГОСТ Р 55576 (раздел 4. приложение А).

Издание официальное

5 Оборудование» материалы и реагенты

5.1 Требования к оборудованию – по ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025.

5.2 При проведении испытаний применяют оборудование и материалы по ГОСТ 31719. а также следующие:

– бокс ламинарный II класса биологической безопасности;

– отсасыеатель вакуумный медицинский с колбой-ловушкой для удаления над осадочной жидкости;

• микропробирки одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся вместимостью 1.5 см3;

– микропробирки одноразовые полипропиленовые вместимостью 0,2 см3:

• ПЦР-бокс;

• прибор для проведения ПЦР;

– халаты медицинские.

Допускается использование другого оборудования и материалов с техническими характеристиками не хуже указанных выше.

5.3 При проведения испытаний применяют реагенты для экстракции ДНК по ГОСТ Р 55576. а также следующие реагенты, праймеры и зонды для проведения ПЦР и амплификации.

5.3.1 Реагенты:

– вода деионизованная;

– ПЦР-буфер;

• раствор дезоксииуклеотидтрифосфатое (дМТФ) 10х (10-кратная смесь четырех компонентов с концентрацией каждого компонента 1,76 * 10’3 моль/дм3);

– 7афполимераза термостабильная.

• образцы стандартные состава ГМ сои и ГМ кукурузы, содержащие от 0.1 % до 5.0 % линий ГМ сои и ГМ кукурузы .

Допускается использование других реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных выше.

5.3.2 Праймеры (смесь олигонуклеотидов) и зонды (меченные флуоресцентными красителями FAMnRSG);

5.3.2.1 Для определения ГМ сои линии 40-3-2:

а) специфичные целевой последовательности:

1) праймер 1:5‘- GCC ATG TTG ТТА ATT TGT GCC АТ 3*;

2) праймер 2; 5 • GAA GTT CAT ТТС ATT TGG AGA GGA С 3‘;

3) зонд: 5 – FAM-CTT GAA AGA ТСТ GOT AGA GTC AGC TTG ТСА GCG – BHQ1-3*;

б) специфичные гену лектина (/eel):

1) праймер 1: 5′-ТСС ACC ССС АТС С АС ATT Т -3‘;

2) праймер 2: 5’- GGC АТА GAA GGT GAA GTT GAA GGA-3‘;

3) зонд: 5’ – R6G-AAC CGG TAG CGT TGC CAG СТТ CG -BHQ1 -3‘;

5.3.2.2 Для определения ГМ сои линии А2704-12:

а) специфичные целевой последовательности:

1) праймер 1: 5 – GCA AAA AAG CGG TTA GCT CCT-3

2) праймер 2:5 – ATT CAG GCT GCG CAA CTG TT-3*:

3) зонд: 5 – F AM-CGG ТСС TCC GAT CGC CCT TCC-BHQ1-3′;

б) специфичные гену лектина (/ec2):

1) праймер 1: 5 -CAC СТТ TCT CGC ACC AAT TGA CA-3*;

2) праймер 2: 5 -TCA AAC ТСА АСА GCG ACG AC-3’;

3) зонд: 5 -R6G-CCA CAA АСА CAT GCA GGT TAT CTT GG -BH01 -3

5.3.2.3 Для определения ГМ сои линии А5547-127: а) специфичные целевой последовательности:

1) праймер 1: 5 – GCT ATT TGG TGG CAT TTT ТСС А 3‘;

2) праймер 2: 5’- САС TGC GGC CAA СТТ ACT ТСТ 3‘;

3) зонд: 5 – FAM-CC GCA ATG ТСА ТАС CGT CAT CGT TGT-BHQ1-3*;

6) специфичные гену лектина (/есЗ):

1) праймер 1: 5 – CCT ТСТ CGC ACC AAT TGA СА -3*;

2) праймер 2: 5 – ТСА ААС ТСА АСА GCG ACG АС -3‘;

Прибор для проведения ПЦР «Rotor-белев 2000/3000/6000 (aCorbett Research». Австралия). Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.

‘ Стандартные образцы состава ГМ сои и ГМ кукурузы «Сигма Алдрич».ССМ от JRC, IRMM. Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.

3) зонд: 5-R6G-CC АСА ААС АСА TGC AGG ТТА ТСТ TGG-BHQ1 -34

5.3.2.4 Для определения ГМ кукурузы линии MON 810:

а) специфичные целевой последовательности:

1) праймер 1: 5-TCG AAG GAC GAA GGA СТС ТАА CGT-3′:

2) праймер 2: 5-GCC ACC ТТС СТТ ТТС САС ТАТ СТТ-3*:

3) зонд: 5-FAM-AAC АТС СТТ TGC CAT TGC CCA СС-ВНО^З’;

б) специфичные гену зеина (bmg):

1) праймер 1: 5-TTG GAC TAG AAA ТСТ CGT GCT GA-3*;

2) праймер 2: 5-GCT АСА TAG GGA GCC TTG ТСС T-3‘:

3) зонд: 5-R6G-CAA ТСС АСА САА ACG САС GCG TA-BHQ1-3’:

5.3.2.5 Для определения ГМ кукурузы линии NK 603:

а) специфичные целевой последовательности:

1) праймер 1: 5-ATG ААТ GAC СТС GAG ТАА GCT TGT ТАА-3’;

2) праймер 2: 5-AAG AGA ТАА CAG GAT ССА СТС ААА САС Т-3‘;

3) зонд: 5-FAM-TGG ТАС САС GCG АСА САС ТТС САС TC-BHQ1-3′:

б) специфичные гену зеина (adhl 1):

1) праймер 1: 5-ССА GCC ТСА TGG CCA AAG-3’;

2) праймер 2: 5-ССТ ТСТ TGG CGG СТТ АТС TG-3’;

3) зонд: 5-R6G-CTT AGG GGC AGA СТС CCG TGT ТСС CT-BHQ1-3’;

5.3.2.6 Для определения ГМ кукурузы линии ВН1:

а) специфичные целевой последовательности:

1) праймер 1: 5-GCG GAA ССС СТА ТТТ GTT ТА-3‘;

2) праймер 2: 5-ТСС AAG ААТ ССС ТСС ATG AG-3’;

3) зонд: 5-FAM-AAA ТАС ATT САА АТА TGT АТС CGC ТСА-ВН01 -3′:

б) специфичные гену зеина (adhl 2):

1) праймер 1: 5-CGT CGT ТТС ССА ТСТ СТТ ССТ СС-3*:

2) праймер 2: 5-ССА СТС CGA GAC ССТ CAG ТС-3’;

3) зонд: 5-R6G-AAT CAG GGC ТСА ТТТ ТСТ CGC ТСС 7СА-ВН01-3’:

5.3.2.7 Для определения ГМ кукурузы линии Т 25:

а) специфичные целевой последовательности:

1) праймер 1: 5’- АСА AGC GTG TCG TGC ТСС АС-3’;

2) праймер 2: 5 – GAC ATG АТА СТС СТТ ССА CCG-3

3) зонд: 5 -FAM-TCA TTG AGT CGT ТСС GCC ATT GTC G.BHQ1-3’;

б) специфичные гену зеина (adhi 3):

1) праймер 1: 5 -CGT CGT ТТС ССА ТСТ СТТ ССТ ССТ-3′;

2) праймер 2: 5-ССА СТС CGA GAC ССТ CAG ТС-3’:

3) зонд: 5-R6G-AAT CAG GGC ТСА ТТТ ТСТ CGC ТСС TCA-BHQ1-3*;

5.3.2.8 Для определения ГМ кукурузы линии GA 21:

а) специфичные целевой последовательности:

1) праймер 1: S-СТТ АТС GTT ATG СТА ТТТ GCA ACT ТТА GA-3’;

2) праймер 2: 5-TGG СТС GCG АТС СТС СТ-3′:

3) зонд: 5-FAM-CAT АТА СТА ACT CAT АТС ТСТ ТТС ТСА АСА GCA ССТ GGG-BHQ1 -3’;

б) специфичные гену зеина (adhl А):

1) праймер 1: 5 -ССА GCC ТСА TGG ССА AAG-3′:

2) праймер 2: 5 -ССТ ТСС TTG GCG GCT TAT CTG-3’;

3) зонд: 5 -R6G-CTT AGG GGC AGA СТС CCG TGT ТСС CT-BHQ1-3

5.3.2.9 Для определения ГМ кукурузы линии MIR 604:

а) специфичные целевой последовательности:

1) праймер 1: 5 -GCG САС GCA ATT САА CAG-3*:

2) праймер 2: 5 -GGT CAT ААС GTC ACT ССС ТТА АТГ СТ-3*:

3) зонд: 5 -FAM-AGG CGG GAA ACG АСА АТС TGA ТСА TG-BHQ1 -3’:

б) специфичные гену зеина (adhl 5):

1) праймер 1: 5 -CGT CGT ТТС ССА ТСТ СТТ ССТ СС-3*;

2) праймер 2: 5 -ССА СТС CGA GAC ССТ CAG ТС-3’:

3) зонд: 5-R6G-AAT CAG GGC ТСА ТТТ ГСТ CGC ТСС TCA-BHQ1-3 :

5.3.2.10 Для определения ГМ кукурузы линии MON 863: а) специфичные целевой последовательности:

1) праймер 1:5**GTA GGA TCG GAA AGC TTG GTA С -3*;

2) праймер 2: 5 -TGT ТАС GGC СТА ААТ GCT GAA СТ-3′;

3) зонд: 5 -FAM-TGA АСА ССС АТС CGA АСА AGT AGG GTC A-BHQ1-3* ;

б) специфичные гену зеина (adhi 6):

1) праймер 1: 5-ССА GCC ТСА TGG CCA AAG-3*;

2) праймер 2: 5-ССТ ТСТ TGG CGG СТТ АТС TG-3*:

3) зонд: 5-R6G-CTT AGG GGC AGA СТС CCG TGT ТСС СТ-ВН01-3*.

6 Сущность метода

6.1 Сущность метода идентификации и количественного определения содержания ГМ сои и ГМ кукурузы методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Rea/ Tima PCR) заключается в проведении двух независимых ПЦР в одной пробирке с использованием специфичных праймеров и зондов, меченных флуоресцентными красителями, с целью выявления участка эндогенной ДНК. характерной для всех пиний ГМ сои или ГМ кукурузы, и участка рекомбинантной ДНК. специфичной для определенных генетических линий.

6.2 возможно проведение ПЦР в двух пробирках с использованием одного красителя по ГОСТ Р 53244.

7 Отбор проб

Отбор лабораторных проб, подготовка анализируемой пробы, условия хранения и транспортирования – по ГОСТ Р 55576

8 Экстракция ДНК

Экстракцию ДНК проводят в соответствии с ГОСТ Р 52173 или ГОСТ Р 55576.

9 Постановка ПЦР и проведение амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR)

9.1 Приготовление реакционной ПЦР-смеси

Для приготовления реакционной ПЦР-смеси для определения ГМ сои или ГМ кукурузы берут 1 мм3 деионизованной воды, по 1 мм3 каждого праймера 1 по 5.3.2 концентрацией 5 * 10*^ моль/дм , по 1 мм* каждого праймера 2 по 5.3.2 концентрацией 5 * 10* моль/дм3. по 1 мм3 каждого зонда по 5.3.2 концентрацией 3 * 10* моль/дм3. 3 мм3 раствора дезоксинукпеотидтрифосфатов (дНТФ) и смешивают в пробирке вместимостью 1.5 см3.

Срок хранения готовой ПЦР-смеси при температуре не выше минус 18 вС – не более 12 мес.

9.2 Постановка ПЦР

9.2.1 ДНК. экстрагированную из анализируемой пробы (включая стандартные образцы), испытывают не менее, чем в двух повторностях.

9.2.2 Для проведения двух независимых ПЦР в одной пробирке смешивают 10 мм3 ПЦР-смеси по 9.1, 5 мм5 ПЦР-буфера и 0.5 мм3 полимеразы (TaqF). Смесь перемешивают и осаждают на мик-роцентрифуге-всгряхивагеле в течение 15-30 с.

9.2.3 В микропробирку вместимостью 0,2 см3 вносят по 15 мм3 смеси, полученной по 9.2.2. затем. используя наконечник с аэрозольным барьером, добавляют в нее 10 мм3 ДНК. полученной экстракцией из анализируемой пробы (ДНК-лроба) в соответствии с разделом 8. Общий объем реакции -2S мм1.

9.2.4 Ставят контрольные реакции амплификации:

• отрицательный контрольный образец (К-) – вместо ДНК-пробы вносят в микропробирку со смесью по 9.2.2 10 мм3 ТЕ-буфера:

• положительный контрольный образец (К+) – вместо ДНК-пробы вносят в микропробирку со смесью по 9.2.2 10 мм3 1 %-ного стандартного образца состава ГМ сои и ГМ кукурузы.

9.2.5 При каждой постановке ПЦР ставят шесть реакций амплификации со стандартными образцами ГМ сои и ГМ кукурузы для построения калибровочной кривой. Для этого в три микропробирки со смесью по 9.2.2 вносят по 10 мм3 каждого стандартного образца, содержащего от 0,1 % до 5.0 % линий ГМ сои и ГМ кукурузы. Реакцию амплификации проводят в двух повторностях.

Примечание – Стандартный образец может иметь любую концентрацию в пределах указанного диапазона.

9.3 Проведение амплификации и детекции флуоресцентного сигнала

Программируют прибор для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

Программа амплификации для количественного определения ГМ сои приведена в таблице 1.

Таблица 1

Детекцию проводят при температуре 60 °С по каналам FAM/Green, JOE!Yellow.

Программа амплификации для количественного определения ГМ кукурузы приведена в таблице

2.

Таблица 2

Детекцию проводят при температуре 55 °С по каналам FAM/Green, JOE/Yellow.

Детекцию флуоресцентного сигнала проводят на каналах FAM и JOE. По каналу FAM регистрируют уровень флуоресценции для генетической линии, по каналу JOE – для эндогенной ДНК ГМ сои или ГМ кукурузы. Кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируют с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме реального времени (Real Time PCRY

Границы интервала, в котором погрешность определения находится с доверительной вероятностью Р = 0,95. составляют от 0.1 % до 5.0 %. нижнюю и верхнюю границы погрешности определяют с использованием стандартных образцов.

Стандартное отклонение повторяемости результатов 6 составляет от 0.067 (для 0.1 %) до 0.54 (для 5 %).

Коэффициент корреляции калибровочной прямой, построенной по стандартным образцам ГМО. [R2) > 0.97. Если коэффициент корреляции R2 менее 0.97 – требуется повторный анализ всех проб, начиная с этапа амплификации.

9.4 Учет результатов

Учет результатов и расчет содержания ГМ сои или ГМ кукурузы проводят по ГОСТ Р 53244.

9.5 Возможные ошибки

Возможные ошибки – по ГОСТ Р 55576 (подраздел 10.3).

УДК 636.086.15:636.086.006.034 ОКС 65 120

Ключевые слова: корма, кормовые добавки, генетически модифицированные организмы, генетически модифицированная соя. генетически модифицированная кукуруза, полимеразная цепная реакция, гибридизационно-флуоресцентная детекция в режиме реального времени, амплификация, рекомби* нактмая ДНК. праймеры, зонды

Подписано в печать 02.02.2015. Формат 60х841/в.

Уел. печ. л. 0,93. Тираж 31 экз. Зак. 298.

Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта

123995 Москва. Гранатный пер.. 4.